2008年，Blackman等人报道了基于逆电子需求Diels-Alder（iEDDA）的四嗪（Tz）和反式-环辛烯（TCO）的生物正交反应。该反应中Tz分子因其独特的化学结构而表现出对生物分子良好的标记、追踪和特异性识别能力。如Figure 1A所示，目前第一代Tz耦合荧光染料的探针体系的设计思路仍是基于Förster共振能量转移（FRET）或者跨键能量转移（TBET）。然而，以上探针则表现出在红光和近红外波段重叠效果不好和FRET效率低等不足。此外，最近有文献报道Dexter能量转移策略在一定程度上能解决FRET和TBET机制带来的问题，即能够使红光/近红外发射的Tz探针的荧光增强（Figure 1B）。下载化学加APP到你手机，更加方便，更多收获。

本文中，Tz探针与BODIPY荧光团结合后得到了单发色团型的暗态荧光探针（Figure 1C）。BODIPY-Tz探针在与BCN结合后展现出荧光增强特性，发射波长范围为520-650 nm。作者还证明了该系列探针可用于活细胞中对不同细胞器的荧光生物成像。基于BCN和TCO的独特结构，BODIPY-Tz展现出独特的荧光响应特性并以此实现了对不同细胞器的双色成像。

BODIPY染料具有α, β和中间位置取代位点 (Figure 2)，有关对BODIPY染料β位进行取代的报道较少。本文中，作者对其α和β位进行Tz分子的修饰，从而得到了BODIPY-Tz探针。基于此，作者合成了一系列BODIPY-Tz分子1-10。

接下来，作者研究了BODIPY-Tz分子的光物理性质。所有的BODIPY-Tz分子在TCO的水溶液中没有表现出荧光“开启”的现象。相反，除了分子6以外其他的BODIPY-Tz化合物的荧光增强（Figure 3A-B）。基于单发色团设计策略，所制备得到的BODIPY-Tz探针具有良好的荧光开关比，发射波长范围覆盖绿光到远红外范围（Figure 3C）。

由于S₀-S₁的光学禁阻跃迁，单发色团型BODIPY-Tz探针的荧光被淬灭。Tz分子的非辐射能量衰减过程使得BODIPY-Tz具备有效的暗态淬灭特性。为了进一步了解化合物的暗态淬灭效率，作者计算了BODIPY-Tz探针的振子强度（f）。如Figure 4A-C所示，分子的f值均小于0.005，可忽略不计，因而S₀-S₁的分子轨道跃迁主要以π→π*为主。此外，分子与BCN的结合物的能级差与理论计算的发射波长数值呈现线性关系（Figure 4D）。因此，理论计算结果与实验数据一致。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者用BODIPY-Tz探针3，4和10与商用线粒体靶向染料共染HeLa细胞。在未清洗细胞的情况下，探针3，4和10可分别实现绿光/红光/远红外通道成像（Figure 5A-C），皮尔森系数均大于0.9，共定位效果良好。同时，探针4和10的荧光强度更是大于商用线粒体染料（Figure 5D-E）。此外，BODIPY-Tz探针5或者10还能够对溶酶体分别进行红光和远红外成像，具有优秀的溶酶体靶向能力（Figure 5F-G）。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接下来，作者对Tz和BCN之间是否发生了生物正交反应并产生了具有荧光特性的BODIPY-Tz-BCN结合物进行了验证。Tz和TCO发生iEDDA反应的主要产物含有1,4-或4,5-二氢吡啶环（Figure 6A）。从图Figure 6B中可以看出所有BODIPY-Tz在与TCO发生iEDDA反应后的荧光增强程度不明显。最后，作者还证明了BODIPY-Tz-BCN结合物诱导了光致电子转移过程（PeT）使得荧光淬灭（Figure 6C-D）。

（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

最后，作者研究了BODIPY-Tz-TCO结合物中二氢吡啶结构对荧光淬灭的影响。从4-TCO结合物在不同溶剂中的荧光光谱可以看出（Figure 7A），随着溶剂极性的降低，4-TCO的荧光量子产率和荧光强度均有增加。相比于4-BCN，4-TCO在甲苯溶液中的光谱发生了移动（Figure 7B）,与实验结果一致。以上结果表明BODIPY-Tz探针的荧光性能是源于其与BCN结合物中的吡啶基团，而BODIPY-Tz探针与TCO的结合物中含有二氢吡啶基团，因此在极性或者水环境中由于PeT过程而荧光减弱。当用探针5对HeLa细胞染色后，可以得到对溶酶体和线粒体的双色成像（Figure 7C），并且荧光信号可以被很好地区分，不存在光谱串扰的问题（Figure 7D-E）。