罗丹明染料具有优异的光物理性能、结构-性质可调性以及良好的生物性而被广泛应用于生物靶向和荧光标记等领域。罗丹明染料结构中存在着亲脂性内酯（L）和两性离子（Z）平衡。通过确定K_L-Z的平衡常数可以优化罗丹明染料的生物性能（Figure 1a）。近期研究表明苯环的氟化可以提升含氮杂环丁烷罗丹明染料的K_L-Z。此外，作者还发现氟化苯环可以更简便地合成罗丹明染料衍生物，该方法中采用了含甲氧基甲基醚（MOM）保护基的2-羟基丙二腈MAC试剂（Figure 1b）。作者通过调研罗丹明染料的合成路线，进而发展了制备氟化罗丹明的新方法。通过修饰不同的助色团取代基，能够显著影响内酯-两性离子平衡，并进一步影响化合物性质。最后，所制备的染料还被成功证明可用于先进光学成像当中。下载化学加APP到你手机，更加方便，更多收获。

作者考察了在二氧六环-和水的体系中不同染料内部的内酯-两性离子平衡（Figure 2）。实验数据表明氟化过程一般会增大K_L-Z，该常数与染料结构中的桥联取代基团密切相关。因此，根据助色团的给电子能力大小（NH₂ < azetidine < pyrrolidine <tetrahydroquinoline < julolidine），SiRh₁₁₀和 JF₆₄₆  的K_L-Z ~ 10⁻³, JFX₆₅₀ 和SiRhQ的 K_L-Z ~ 10⁻², 含 julolidine 基团的SiRh₁₀₁的K_L-Z ~1。

接下来，作者选择三种氟化染料进行后续的生物成像应用研究。作为ATTO 647N（115，Figure 3a）染料的氟化类似物，carborhodamine 59与其进行了对比实验。ATTO 647N-HaloTag用于活细胞成像时，并未实现对细胞核的显著标记（Figure 3b），而这也归因于阳离子罗丹明染料的衍生物更倾向于聚集在活细胞中的线粒体上。作者将染料59_HTL与表达组蛋白H2B−HaloTag融合蛋白的细胞进行培养，从图中可以看出59_HTL对细胞核的染色效果良好（Figure 3c）。此外，作者还比较了59_HTL和89_HTL在单颗粒示踪（SPT）实验中的成像性能表现（Figure 3d）。从Figure 3e中可以看出，59_HTL的亮度较高（Figure 3e）。同时，89_HTL随着成像时间的延长，光漂白的速度较快（Figure 3f）。

近红外窗口具有背景荧光干扰性小、低散射、相对较大的组织穿透深度等优点。作者对比了31_HTL和包括31_HTL、38_HTL等在内的近红外荧光探针的光学性能（Figure 4a）。通过调整合成方法进而得到近红外激发的染料110（Figure 4b）。作者继续测试了该染料在活细胞标记成像当中的实用性。所有的化合物都可以与表达HaloTag的活细胞同时进行靶向，然而在相同激发波长下，31_HTL展现出更高的荧光强度（Figure 4c）。同时，相较于107_HTL和106_HTL，31_HTL展现出良好的光学稳定性和更高的亮度，因而可以实现多色成像（Figure 4d）。

最后，分子 65_HTL与HaloTag 蛋白进行孵育后的吸光度提升了47倍（Figure 5a, b）。作者将远红外淬灭染料作为半合成传感器用于标记cAMP。染料与cAMP结合后的构象发生改变，从而削弱FRET过程，使得受体的荧光寿命提高（Figure 5c, d）。FRET过程的构建是以65_HTL作为受体，88_STL作为给体。基于荧光寿命显微镜（FLIM），实验数据表明细胞的寿命为 2.34 ± 0.10 ns（Figure 5d, e）。该数据显著低于只用JFX612给体标记的细胞寿命（4.30 ± 0.01 ns），由此表明JQ645-HaloTag是FRET过程的淬灭剂。此外，使用forskolin（腺苷酸环化酶激活剂）增加细胞内cAMP的浓度后会使染料分子的寿命提高至3.32 ± 0.18 ns，证明JQ645-HaloTag可被用作为自标记探针检测细胞内标志物。