产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌（CPE）是一种革兰氏阴性菌，它可通过位于细菌细胞间质的碳青霉烯酶有效水解碳青霉烯类抗生素的C-N键（如亚胺培南，美罗培南，厄他培南等），继而导致这些药物失效，使临床抗感染治疗陷入无药可用的危机。同时因为大多数碳青霉烯酶基因位于质粒、整合子、转座子等可转移性基因元件上，可导致耐药基因在不同菌种间快速传播，诱发医院内感染或爆发流行。鉴于其高感染率、高致死率和高传播性，CPE已成为当今全球最严重的公共卫生威胁之一。酶的活性受其细胞内生理环境的精细调控，因此，评估天然细胞环境中碳青霉烯酶的酶促反应对于获得其准确催化活性信息以及早期疾病检测至关重要。

图1.（a）实验流程示意图。（b）用亚胺培南或缓冲液滴定活KPC-Kp悬液的反应热谱图。 （c）用亚胺培南滴定阴性细菌悬液（ESBL-Kp和AmpC-Kp）和KPC蛋白的热谱图。（d）EDTA或舒巴坦对KPC-Kp水解亚胺培南热谱曲线的影响。

由于任何酶促化学反应都伴有一定的热量吸收或释放，并且热量的变化速率和酶催化速率成正比，因而反应量热法可以为监测天然底物与酶的反应进程提供一种普适、有力的研究工具。又因为量热法也适用于溶剂不透明或混浊的溶液，为复杂体系内研究酶活提供了可能。如图1所示，作者通过比较产KPC 酶肺炎克雷伯菌悬液（KPC-Kp）与纯化的KPC 酶溶液（A类碳青霉烯酶）水解亚胺培南过程中的热谱曲线证实了细胞量热法（in cell-calorimetry）的可行性。进一步，作者观察到用KPC-Kp所得到的热量变化可以被A类碳青霉烯酶抑制剂舒巴坦完全抑制，而B类碳青霉烯酶抑制剂EDTA对其没有影响，证实热变化曲线可以特异性地反映亚胺培南在活细菌中被水解的过程。

图2. OXA-48型碳青霉烯酶催化亚胺培南（IMI）具有“双相动力学”特征。补充CO₂对（a）量热法中OXA-48-Kp悬液和（b）紫外光谱法中OXA-48-Kp裂解上清液水解亚胺培南的催化活性的影响。

随后作者揭示了OXA-48型碳青霉烯酶的热谱曲线具有特异的“双相动力学”特征（图2）。该特征随NaHCO₃浓度的提高而消失，证实OXA-48酶在催化过程中其活性中心的赖氨酸会发生去羧基化，进一步导致酶在催化过程中失活，该特征可以作为特征“指纹”图谱用于携带OXA-48细菌的特异性检测。同时作者对比了量热法和紫外分光光度法检测OXA-48型碳青霉烯酶水解活性的谱图，发现量热法可以更灵敏地揭示催化过程中反应速率的变化，因此在研究这种特殊的反应机理方面具有显著优势。

图3.比较了分别使用（a）量热法和（b）Carba-NP法检测产KPC碳青霉烯酶活细菌的灵敏度。

接着，作者对量热法检测产碳青霉烯酶细菌的灵敏度做了测试，并将其与临床实验室广泛采用的Carba NP方法进行了比较（图3）。结果表明细胞量热法可以准确检测所有临床常见的碳青霉烯酶，检测下限为3-19 nM碳青霉烯酶（10⁶-10⁸ 细菌）。该结果比Carba NP方法检测灵敏度至少高2个数量级。

图4. 细胞量热法检测142株临床细菌的结果及其与其它方法的对比。碳青霉烯酶阳性样品标记为“+”，碳青霉烯酶阴性样品标记为“ - ”。红色虚线表示细胞量热法的检测阈值。

作者最后对细胞量热法在CPE快速检测领域的应用进行了验证（图4）。实验采用了来自西安交通大学第一附属医院分离的142株临床细菌作为样品，分别采用细胞量热法、Carba NP方法、mCIM法、MHT法和MIC法进行平行实验。检测结果表明细胞量热法具有最佳检测灵敏度（97％）和特异性（100％），在检测时间方面也具有明显优势（10分钟内），有望应用于临床耐药细菌的快速检测。

总结：本文报道了一种基于碳青霉烯酶催化底物过程中的“热信号”变化来特异性、实时、原位跟踪细胞内酶活的实验方法，并证明了该技术在新型催化机理和快速鉴定临床CPE方面的应用。由于细胞量热法概念简单，易于应用于复杂生物体系（例如，肿瘤细胞、免疫细胞和囊泡等），因而具有广泛应用前景。

通讯作者介绍

和媛，女，化学博士，西北大学化学与材料科学学院副教授，硕士研究生导师，第八批“陕西省百人”。 2011年获得英国约克大学 (the University of York) 博士学位，2011-2013年分别在加拿大Simon Fraser University（David Vocadlo 教授实验室）和美国斯克利普斯研究所 (The Scripps Research Institute; Jim Paulson 教授实验室) 进行博士后研究，2013年加入西北大学。和媛副教授课题组主要从事疾病相关靶酶反应机理及活性调控研究，主要研究手段包括：X-射线晶体衍射、酶学、等温滴定微量热（ITC）等。研究成果发表在包括Angewandte Chemie, JACS, Nature Structural & Molecular Biology, Nature Chemical Biology 等在内的著名国际期刊。现主持国家自然科学基金和陕西省择优资助项目。

徐纪茹，女，医学博士，西安交通大学医学部基础医学院病原生物学教授、博士研究生导师，陕西省“三秦人才”。1982年获西安医学院医学学士学位，1990年获西安医科大学医学硕士学位，2001年获得英国贝尔法斯特Ulster大学博士学位，2004年聘为西安交通大学医学院病原生物学教授。主要研究方向：1. 正常菌群与宿主的依存关系；2. 感染性疾病的分子诊断；3. 细菌耐药基因研究。共发表论文100余篇，培养博士和硕士研究生30余名。主要社会任职：1. 中国微生物学会真菌专业委员会委员；2.中国微生物学会微免专业委员会委员；3. 陕西省微生物学会副理事长；4. 陕西省医学会微生物学与免疫学分会副主任委员。