不对称催化是现代合成化学中制备手性分子的核心技术。在传统热催化中，手性催化剂通过降低反应活化能垒，选择性活化与之结合的底物，从而实现手性诱导。然而，在光催化反应，特别是通过能量转移（EnT）途径进行的反应中，一个根本性挑战在于：在非选择性的光照条件下，游离于催化剂之外的底物同样会被激发，进而发生非手性的背景反应，导致产物对映选择性下降。

尽管通过开发亲和性手性光敏剂或底物发色团活化等策略，已在特定体系中实现了激发态的对映选择性控制，但这些方法通常要求底物的吸收波长与光敏剂有显著差异。对于吸收光谱与光敏剂重叠或更长的底物，其直接激发导致的背景反应难以避免。

钟芳锐和吴钰周团队在前期的研究中，基于基因密码子扩展技术构建了“三重态人工光酶”（Nature, 2022, 611, 715，Nature：首例光酶催化对映选择性[2+2]-环加成反应），利用能量转移活化的空间邻近依赖性和酶空腔的限域效应，实现了能量转移催化吲哚底物的对映选择性[2+2]环加成。这类光酶可利用其固有的手性空腔，通过多重非共价相互作用精确排列底物与光敏剂，实现高效的能量转移与优异的立体控制，例如用于对映选择性[2+2]光环加成反应。然而，BpA辅因子的固有吸收范围（365–390 nm）限制了其应用，且对于在此窗口内有吸收的底物，背景反应问题依然突出。

为解决上述挑战，本研究从自然界的区室化概念中获得灵感，提出了一个集成解决方案：利用蛋白质空腔对反应体系进行物理空间上的分割，创造一个独特的、与外部本体溶液分离的封闭酶腔。

·酶腔内部（催化区室）： 在蛋白质空腔内，遗传编码的BpA光敏剂与底物在限域的手性环境中近距离接近，促进高效且受保护的能量转移过程，实现对映选择性催化。

·本体溶液（淬灭区室）： 在蛋白质结构域外的溶液中，通过引入精心设计的三重态淬灭剂，利用碰撞淬灭机制抑制游离底物因直接激发而产生的背景反应。

该设计的核心在于，通过蛋白质的物理屏障和理性设计的淬灭剂，实现“腔内外”反应路径的精准调控，在促进腔内手性反应的同时，抑制腔外的外消旋路径。

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1. 概念验证与光酶库初筛

研究选取了1-萘酚衍生物1a作为模型底物，因其在300-390 nm的紫外吸收与BpA严重重叠。实验证实，在365 nm光照下，1a存在显著的非催化背景反应（37%产率），且该反应可被氧气（一种已知的三重态淬灭剂）有效抑制，表明背景反应经由底物的三重态进行。

为寻找合适的光酶平台，研究团队构建了一个包含LmrR、CgmR、RamR、QacR、TM1030和tHisF六种不同蛋白质骨架、共24个BpA嵌入突变体的光酶库。在高通量筛选后，发现基于RamR蛋白的变体，特别是RamR_F155BpA（命名为RamR1.0），在催化1a的[2+2]光环加成中展现出最优的活性和对映选择性（厌氧条件下37%产率，30% e.e.）。

图2. 光酶酶库的构建与筛选

2. 三重态淬灭剂的理性设计与优化

在确认RamR1.0的催化能力后，研究系统评估了不同淬灭剂对反应的影响。

·氧气： 在空气和氧气氛围下，反应的e.e.值分别提升至34%和46%，印证了区室化淬灭的概念。然而，氧气同时引发了底物和产物的氧化副反应，导致质量平衡下降。

·常规小分子淬灭剂： 测试了(E)-1,2-二苯乙烯（TQ1）、2,5-二甲基己-2,4-二烯（TQ2）和苝（TQ3）。尽管TQ1和TQ2能提升e.e.值，但它们严重抑制了转化率，推测是由于这些疏水性小分子可自由进入酶腔，干扰了内部的EnT过程。

·定制化淬灭剂： 为克服上述限制，团队设计了(E)-4-苯乙烯基苯甲酸（TQ4）。在反应pH条件下，TQ4的羧基处于去质子化状态，带负电。由于RamR活性中心入口周围富集了多个带负电荷的酸性氨基酸残基（如Glu129, Asp132等），静电排斥作用阻止了TQ4进入酶腔，使其能够选择性地淬灭溶液中的激发态底物。实验结果证实，TQ4在显著提升对映选择性的同时，保持了良好的反应性和质量平衡。

·大分子淬灭剂： 进一步合成了二苯乙烯功能化的牛血清白蛋白（BSA-TQ1），利用其巨大的分子尺寸实现空间排斥，同样取得了成功。

瞬态吸收光谱分析为区室化保护提供了直接证据：RamR1.0-BpA的激发态寿命在氧气存在下几乎不变，而游离BpA的寿命则被氧气显著淬灭，表明蛋白质空腔有效保护了内部光敏剂免受外部淬灭剂的影响。

图3. 三重态淬灭剂的概念验证

3. 蛋白质工程与催化性能提升

以RamR1.0为起点，研究团队通过聚焦半理性定点饱和突变对其进行了定向进化。基于RamR的晶体结构和分子对接模拟，对底物结合口袋周围的12个残基进行突变，最终获得了最优变体RamR3.0（F155BpA/K63R/S67W/S134A）。

RamR3.0与底物1a的复合物晶体结构（分辨率2.50 Å）揭示了其高选择性机制：BpA光敏剂与底物萘环之间的距离为5.7 Å，确保了高效的三重态能量转移。突变残基R63与底物的苄基形成π-阳离子相互作用。突变残基A134与底物的萘基形成π-烷基相互作用。此外，底物还与T55、A110、V138、D152、L156、M184等多个残基存在广泛的非共价相互作用网络，包括C-H…π、π-硫、π-σ和π-烷基作用。底物的苄基与BpA之间存在π-π堆积作用。这些相互作用共同将底物稳定在特定构象，使其烯烃侧链优先接近萘环的一个对映异位面，从而实现了高度的立体控制。在TQ4存在下，RamR3.0催化模型反应的产率达70%，对映选择性高达94% e.e.。

图4 人工光酶的定向进化和晶体解析

4. 底物普适性与策略通用性

研究考察了RamR3.0-TQ4体系对多种1-萘酚及2-萘酚衍生物的适用性。结果表明，带有不同电性取代基的底物、酚酯、苄酯同系物、含氮杂环底物以及更具挑战性的萘基酮类底物，在该体系下大多能以良好至优秀的产率和对映选择性（多数 >90% e.e.）得到相应的环加成产物。淬灭剂TQ4在所有案例中均一致地提升了产物的立体化学纯度。

图5. 底物普适性

该区室化策略被证明具有广泛的通用性：成功应用于基于噻吨酮辅因子的人工光酶（CMP4.0）催化的环加成反应。在间歇反应和连续流光反应器中均能稳定运行。在克级规模的流动化学合成中，产物2m以98%的分离产率和91% e.e.获得，展示了其应用于规模化合成的潜力。实现了全细胞光生物催化。在表达RamR光酶的大肠杆菌细胞内，尽管胞内环境复杂，仍能成功实现1m的光环加成，获得73%产率和82% e.e.。添加TQ4后，对映选择性进一步提升，且细胞在光照后仍保持高活性（存活率>97%），证明了该策略在生命体系中的适用性。

图6. “空间分区“光酶催化策略的通用性和兼容性

本研究成功开发了一种生物催化“区室化”策略，通过整合人工三重态光酶与定制的三重态淬灭剂，有效解决了不对称能量转移催化中的外消旋背景反应这一关键科学问题。该工作不仅拓展了人工光酶的工具箱，更重要的是展示了一种通过物理空间分区来精准控制光化学反应路径的创新范式。随着合成生物学与蛋白质工程技术的不断发展，这种将生物区室化优势与合成化学理性设计相结合的策略，有望在复杂手性分子的绿色合成、生物相容性光化学以及细胞内的精准合成生物学等领域发挥重要作用。

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